ELISA（免疫酶聯吸附實驗）是免疫學基礎實驗之一，大部分生命科學領域的科研工作者對其都不陌生。因為其特異性強，靈敏度高，可精確定量的特性，在基礎科研和臨床診斷中，ELISA技術都應用廣泛，相信很多關注我們的小伙伴也都做過ELISA。 ELISA實驗步驟少，流程短，購買的即用型試劑盒也都有指導性很強的操作說明書，單次實驗3-6小時即可得到結果，實驗小白也可以很快的上手。但是，各位同學可不要輕視哦，ELISA和WB、IHC等基礎免疫實驗一樣，都是易學難精，上手容易，但想要得到穩定的結果，還是要花一點心思的。這里匯總了一些做ELISA的客戶咨詢我們的問題，把其中有代表性的集中做成了FAQ，大家快看看這其中有沒有困擾你ELISA實驗的問題吧！
1：ELISA可以檢測胞內蛋白么？ 可以的，大部分ELISA指標均為炎癥因子、趨化因子等分泌類型蛋白，支持的樣本類型也多為血清、血漿、細胞培養上清等液體樣本。如需檢測胞內蛋白，首先需要確認待測指標是否在胞內表達，然后選用支持組織勻漿樣本的ELISA試劑盒即可，將組織樣品或細胞樣品進行裂解，提取胞內蛋白后進行蛋白定量，保證每孔上樣總蛋白量一致即可。
2：ELISA可以測DNA的表觀么？不可以，ELISA是利用免疫學原理，定量檢測蛋白質表達的技術。測DNA表觀遺傳學，主要是檢測DNA甲基化，可以選用ChIP技術。
3：夾心法ELISA實驗中的捕獲抗體和檢測抗體是同一個抗體么？不是的，在雙抗夾心法ELISA實驗中，會同時用到捕獲抗體和檢測抗體，這兩個抗體是針對同一抗原蛋白的不同抗原位點的兩種抗體，這樣才可以同時結合抗原分子。這也是雙抗夾心法ELISA不適用與小分子抗原和半抗原等待測指標的原因。
4：試劑盒里面有捕獲抗體么？即用型ELISA試劑盒中，捕獲抗體已經預包被至試劑盒中的ELISA板上，沒有單獨的捕獲抗體提供，直接使用ELISA板孵育稀釋后的樣本及標準品即可。非即用型的ELISA試劑盒會有捕獲抗體提供，需按照說明書推薦的工作濃度，用稀釋液稀釋后自行包被。
5：捕獲抗體如何包被在96孔板上？如果選用的是生物即用型ELISA試劑盒，無需進行抗體包被，因為試劑盒中的檢測抗體已經事先包被在檢測板中；如果是非即用型的ELISA試劑盒，需要自己在實驗前提前進行抗體包被，簡要步驟入下：首先，要選擇ELIS*別的板子，材質應為聚苯乙烯；然后用抗體包被液將捕獲抗體稀釋（pH9.6的碳酸鹽緩沖液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl）成工作濃度，再每孔加100 μl（96孔板加樣量）稀釋后的捕獲抗體，室溫或4℃過夜包被，然后進行洗板和封閉之后再次洗板即可使用，如需長期保存，則需要真空凍干后保存。
6：ELISA實驗中，酶標抗體是什么抗體？識別的目標又是什么？這個問題需要具體分析，在直接法ELISA中，酶標抗體直接識別抗原，即可檢測，但缺少二抗放大，且靈敏性不高。在間接法ELISA中，酶標抗體作為二抗，識別檢測抗體。而在目前應用*的雙抗夾心法ELISA中，酶標抗體識別的也是檢測抗體，對檢測抗體進行識別和酶標記。
7：試劑盒有推薦樣本稀釋濃度還需要自己測嗎？生物試劑盒一般會給出不同樣品類型的的推薦稀釋比例，但是為大致范圍，最好還是根據自己的樣本情況，設計預實驗測量計算。尤其是待測蛋白為炎癥因子時，因為在不同組別樣本間差異巨大，更是需要預實驗檢測后稀釋。
8：做實驗前怎么知道待測血清中炎癥因子的范圍呢？多大是高多小是低？需要根據文獻推測，一般在健康人樣本中，炎癥因子表達很低，接近ELISA檢測下限，樣品無需稀釋或1:1稀釋即可，如已知為炎癥疾病或造模樣本，可參考文獻，在預實驗中設置1:10-100（或更高）的稀釋比例，預實驗檢測后確定最佳濃度進行正式實驗。
9：ELISA實驗中，檢測計算抗原的濃度，臨界值怎么確定？根據曲線測定的濃度，建議落在標準曲線的中間位置較好，極限最好不要超過標準曲線的上下限，如果超出較多，會影響計算結果準確性，建議調整稀釋比例。
10：配好的抗體沒用完如何保存，可保存多久？預實驗用了一個試劑盒里面的部分板子和試劑，剩下的板子和試劑還能繼續用于正式實驗嗎？ 針對艾迪抗的ELISA試劑盒來講，在說明書中有各組分拆開后的保質期，配好的母液和拆封的板子，可以在四度保存，保質期為一個月左右。剩下的板子和試劑在保質期內是可以繼續用于正式實驗的，為保證實驗質量，還是建議間隔時間不要太長，一周之內更好，需注意試劑避免污染，板子保持干燥。
11：in vivo實驗周期長，不太好做預實驗，對ELISA結果會有影響么？怎么辦？如果您實驗室之前建立的in vivo實驗protocol經過驗證，可以保證有效性，那么，可以不用再進行相關的預實驗；并且，如果實驗周期較長，樣本獲取不易，同時又需要檢測較多指標，建議將樣品分裝凍存，避免反復凍融。ELISA實驗還是建議進行一下預實驗，摸清楚樣本的最佳稀釋比例，取得更好的實驗結果。
12：檢測樣本是細胞培養上清，那么細胞數目對炎癥因子的濃度有影響嗎？有影響，所以不同樣本可以比較的前提條件是培養細胞數水平接近一致。因不同處理，可能會導致細胞生產狀態不同，要保證在鋪板時接種細胞數量水平一致。
13：打開試劑盒，發現wash buffer析出結晶，對實驗結果有影響么？怎么辦？ wash buffer為高濃度鹽溶液，在低溫保存條件下，有可能出現結晶析出，為正?，F象，可以放在37℃或55℃烘箱中，析出的結晶會溶解，溶解后可正常使用。不可以在結晶存在的情況下配置wash buffer。
14：一般ELISA試劑盒顯色液是雙組份的，有些其他品牌的是單組分的，使用單組分的有影響么？ HRP酶標二抗的ELISA試劑盒，顯色底物一般為TMB，TMB不穩定，曝光或污染氧化后會出現顯色反應，導致實驗背景升高，或無法使用，一般試劑盒將顯色液調整為雙組份，方便穩定保存，僅在使用前混合，避免了TMB的不穩定影響實驗結果。如您選用的試劑盒為單組分顯色液，在使用前檢測是否為無色透明，如果是正常的，對結果也沒有影響，可以放心使用。
15：同一樣品多次ELISA檢測，測試結果差異大怎么解決？應考慮的問題包括：樣本保存不當，會導致多次實驗結果偏差較大，樣本應盡量減少反復凍融，如需多次檢測，需在取樣后分裝保存；樣品凍融之后未混勻，應混勻后再上樣；加樣不準確，微量樣品加樣時要注意移液器槍頭不要有殘留
16：副孔差別比較大，是沒洗干凈嗎？復孔值差異較大，主要原因應考慮加樣是否準確，洗板過程中是否有殘留以及是否有交叉污染。加樣應注意移液器量程，以及槍頭殘留問題；洗板過程應注意不要有殘留液體，需要進行拍干操作；孵育過程要更換封板膜，拍干過程要換吸水紙，避免交叉污染。
17：加完終止液之后測的幾次數據差別也蠻大，是什么原因？加完終止液后，顯色反應也不是永遠停止，形成的黃色顏色會隨著時間延長繼續加深，建議在15 min內讀數。
18：整個過程需要避光嗎？避光需要避到什么程度呢？ELISA實驗中，在酶標抗體孵育，以及顯色底物孵育這兩步建議避光，其他步驟無需避光。避光可采用錫紙包裹，或將整個ELISA板子放入暗盒或抽屜等無光處即可。
19：封板膜什么時候用？每次加液后都要換嗎？封板膜在孵育樣品、檢測抗體以及HRP酶標抗體時，都要蓋好封板膜，減少揮發及污染幾率。每次使用后要更換新的封板膜。
20：ELISA實驗中的洗板步驟如果沒有洗板機，需要如何操作？生物實驗室ELISA實驗做的較多，還是建議使用洗板機洗板，效果更好，也更方便控制。如果沒有洗板機，在洗板過程中，需要注意洗板液添加后不要從孔中溢出，在加洗板液后，靜置1-2min，甩干液體后，在吸水紙上大力拍干；重復三次。
21：手動洗板過程中，拍過抗體或抗原的濾紙需要扔嗎？是需要更換的，防止造成交叉污染，影響實驗結果的準確性。
22：ELISA實驗中，檢測計算抗原的濃度，臨界值怎么確定？根據曲線測定的濃度，建議落在標準曲線的中間位置較好，極限最好不要超過標準曲線的上下限，如果超出較多，會影響計算結果準確性，建議調整稀釋比例。
23：ELISA實驗中，檢測計算抗原的濃度，臨界值怎么確定？根據曲線測定的濃度，建議落在標準曲線的中間位置較好，極限最好不要超過標準曲線的上下限，如果超出較多，會影響計算結果準確性，建議調整稀釋比例。
24：測得的值都低于標準曲線的低值，是什么原因，應該怎么解決？ 這種情況需要設置實驗對照組來排查，建議在實驗組別設置中添加陽性對照孔，用明確表達的樣品作為陽性對照，如果標準曲線及陽性樣品均可測得正常的表達濃度，則表明實驗成功，檢查其他待測樣品是否稀釋倍數過高，可以降低稀釋比，直至直接加樣本原液，如還檢測不出，則表明該指標在其余待測樣品表達含量低于檢測下限，按照0計算即可。這種情況尤其對于炎癥因子較為常見，在健康樣本中，表達含量極低。
25：標準曲線在推薦的濃度下，r2值為0.9，做了多次都是這樣，怎么辦？這種情況首先要仔細核對產品說明書，看是否用了推薦的擬合方法，一般的ELISA試劑盒，需要使用四參數擬合方式進行擬合，用錯擬合方式，會導致r2值較低；如擬合方式無誤，需檢查是否有個別標曲孔數值異常，排查實驗過程中是否出現污染或標準品倍比稀釋時出現失誤，導致加樣不準。
26：樣本總是在標準曲線之外，稀釋100倍也是，怎么辦？在設置稀釋倍數之前，需要參考相關文獻，對于一些表達*的蛋白，確實會出現這種情況，之前接到過的案例，樣品需要稀釋10000倍，目的蛋白才落在檢測區間內。建議繼續提高稀釋比例。
27：最后顯示的OD值在多少之間屬于可用值，有要求嗎？ 有的，建議標準曲線最高濃度點的OD值在2.0左右較好，也可參考說明書標曲的數據。
